原理：細胞是構成生命的基本單位，在自然界中存在有單細胞生物與多細胞生物。細菌、真菌等單細胞生物，單一細胞即能執行生命程序；高等動植物則是由許多細胞所組成的生命體，藉由分化作用使每個細胞執行不同的功能，共同完成生命程序。但不論何種生物的細胞內都有許多不同分子，在維持細胞生命時負責調控其生理與生化的功能。所以，如果想要在細胞分子生物的相關領域進行研究，細胞的培養是一門基本的技術。以人工配制的基礎培養液，加上動物血清與必需生長激素，可讓細胞在離開生物體后，還可用人工方式培養，讓細胞得以存活并生長、增殖。

 

儀器用具：過濾瓶、血清瓶、抽氣馬達、過濾頭(濾膜孔徑0.22 ?m)、濾膜(孔徑0.45 ?m)、二氧化碳水套式培養箱、倒立式顯微鏡、無菌操作臺、恒溫水浴槽、酸堿度計、10公分細胞培養皿、無菌定量吸管。

 

藥品試劑：小鼠胚胎細胞株NIH/3T3、細胞培養基粉末DMEM (high glucose)、碳酸氫鈉、濃鹽酸水溶液 (6 N HCl)、100X抗生素PS混合液、小牛血清 (bovine calf serum, CS)、胰蛋白酶-EDTA (Trypsin-EDTA) 溶液、10X Phospate Buffer Saline (80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 加蒸餾水至1公升)。

 

步驟：

1.       熱去活化(heat inactivation)小牛血清：

(1)      將小牛血清自-80℃或-20℃冷凍柜移至4℃冷藏柜解凍

(2)      置于56℃的恒溫水浴槽30分鐘 (期間不時搖晃)。

(3)      以無菌管分裝，并貯存于-20℃下備用，或直接加入非完全細胞培養液中以配制完全培養液。

2.       配制細胞培養液

(1)      DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)：將足以配制1公升培養液的培養基粉末與1.5 g的碳酸氫鈉先溶于950 ml的二次水，再以6 N HCl調整pH至7.0–7.2之間；加二次水至總體積為1公升后，先以0.45 ?m濾膜粗濾，再移至無菌操作臺內，以0.22 ?m過濾頭過濾，置于4℃備用。

(2)      完全培養液 (Complete Medium)：每公升DMEM培養液添加10 ml的100X抗生素PS混合液，使青黴素(penicillin)與鏈黴素(streptomycin)的濃度分別為100 IU/ml及100 ?g/ml，并加入10%小牛血清。

3.       細胞次培養 (subculture)：

(1)      將培養皿自含有5%二氧化碳、37℃的恒溫箱中移至倒立式顯微鏡下，觀察細胞密度與其生長情形。

(2)      將欲進行次培養的培養皿中的原培養液倒于廢液瓶中。

(3)      以適量的1X PBS清洗培養皿上的細胞。

(4)      加0.5–1 ml的trypsin-EDTA溶液至培養皿中，并前后左右晃動培養皿，使trypsin-EDTA溶液均勻覆蓋于細胞上。

(5)      將培養皿置入二氧化碳水套式培養箱2–3分鐘后，移至顯微鏡下觀察。若細胞已變圓，即拍打培養皿，并加入1–2 ml培養液沖脫細胞后，以吸管移至無菌離心管中。

(6)      以1000 rpm離心5分鐘后，倒掉培養液，輕敲細胞塊、使之散開。

(7)      若要一分為四，則加4ml培養液至離心管中，并用吸管略為抽吸。

(8)      將9 ml培養液加入已標示之新細胞培養皿，再加入1 ml前項之細胞懸浮液。

(9)      前后左右搖動培養皿，使細胞分散均勻后，置入二氧化碳水套式培養箱培養。

 

                無菌操作臺                              過濾頭

 

 

                倒立式顯微鏡            二氧化碳水套式培養箱

 

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