本文標題：" 細胞內活性氧物質測定法-生物顯微鏡專業門市"

細胞內活性氧物質測定法-生物顯微鏡專業門市

細胞內活性氧物質（intracellular reactive oxygen species; ROS）之測定法

一、原理

H2DCF-DA 是一種染劑對過氧化氫（H2O2）相當敏感，可用來偵測細

胞內產生的過氧化物質。H2DCF-DA 為不具螢光的物質，加至培養液中可經

由擴散作用通過細胞膜進入細胞內；而細胞內的酵素酯醣（esterase）會對

H2DCF-DA 進行去乙醯化作用（deacetylation），進而形成極性的化合物

（H2DCF），因為 H2DCF 無法穿透細胞膜并被留在細胞內；由于其不具螢光

的特性，但當細胞內有過氧化物質存在時，會使 H2DCF 氧化而成為具有螢

光的產物（DCF）。當細胞內活性氧物質產生量越多，H2DCF 被氧化成帶螢

光的產物（DCF）相對提高；故，利用偵測 DCF 螢光強度即可得知細胞內

活性氧物質產生之多寡

并以相對螢光單位（relative fluorescent unit, rfu）為計量單位，表示細胞內活性氧物質的相對含量

二、螢光染劑：2,7-dichloridihydrofluorescein（H2DCF-DA）: Sigma/molecular probe

三、實驗步驟

1. 移除 24 孔盤中的培養液，再加入 500μl 新的培養液。

2. 每孔加入濃度為 20 mM 的 H2DCF-DA，隨即將 24 孔盤置于細胞螢光測

定儀上（cytofluormetry）；設定激發（excitation）波長為 485 nm，發散

（emission）波長為 530；每三分鐘測讀一次，共計三十分鐘

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